細菌內毒素檢查法

細菌內毒素檢查法是判斷供試品中細菌內毒素是否符合規(guī)定。 內毒素(Endotoxin)即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖，其毒性成分為類脂A。菌體死亡崩解后釋放出來。細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。

臨床意義
熱原主要是細菌釋放的一種內毒素，熱原進入機體血液循環(huán)系統(tǒng)會引起發(fā)熱等一系列不良反應，因此，注射劑熱原或細菌內毒素檢查是保證注射劑安全性的重要質量指標。 異常結果：臨床上在進行靜脈滴注大量輸液時，由于藥液中含有熱原，病人在0.5-1h內出現(xiàn)冷顫、高熱、出汗、昏暈、嘔吐等癥狀，高熱時體溫可達40℃，嚴重者甚至可休克。

注意事項
在細菌內毒素檢查方法的建立中，計算內毒素限值L、MVD和MVC時，需要注意大人用劑量、產品規(guī)格、鱟試劑的靈敏度等重要的參數(shù)，因為計算錯誤會導致后續(xù)的所有努力均告失敗。常見的問題有： (1)臨床用藥劑量確定不正確，僅用常規(guī)用藥劑量，未考慮臨床可能的人體大用藥劑量和給藥途徑，在限值計算公式L=K/M中，由于對K值及M值的定義模糊，使K值及M值賦值不準確，終導致限值計算錯誤。例如，某注射劑臨床成人每次靜脈滴注給藥40-80mg，嬰兒(三個月以上)靜脈滴注給藥每次10-20mg。按成人(體重60kg)劑量計算限值為3.75EU/mg，而嬰兒體重僅為5kg左右，計算限值約為1.25EU/mg，如果不考慮臨床每公斤體重大用藥劑量，細菌內毒素限值就會出現(xiàn)較大的差別。 (2)有的申報品種細菌內毒素限值不是根據(jù)臨床用量計算出來，而是根據(jù)同品種熱原檢查的劑量推算出來的，造成限值錯誤。 (3)有的品種細菌內毒素限值從國外藥典抄來，沒有考慮該品種國內上市的臨床使用劑量及中國人與國外人均體重等的差異，也造成限值確定不正確。 (4)錯誤的計算日給藥劑量(一日內多次給藥)。 (5)在品種規(guī)格(濃度)發(fā)生變化時，計算MVD沒有進行調整。 (6)建立方法時所用的大給藥劑量已經超出了臨床所用劑量等。

檢查過程
（1）細菌內毒素標準品為基準物進行標定，確定基重量的相當效價。每1mg工作標準品效價應不小于2EU，不大于50EU，并具備均一性和穩(wěn)定性的實驗數(shù)據(jù)。效價測定方法如下：每批工作標準品至少取4支樣品，使用同一批號鱟試劑、同1支標準品。每支工作標準品按重量、標準品按單位，分別用內毒素檢查用水稀釋制備一系列2倍稀釋度的內毒素溶液，與鱟試劑反應，當4支工作標準品的反應終點的對數(shù)均值的標準差(S)小于0.365時，計算4支工作標準品的反應終點的幾何平均值(以ng/mg表示)及標準品的反應終點值以(以EU/mg表示)，按下式計算。
（2）試驗準備 本法所用的器皿需經處理，除去可能存在的外源性內毒素常用250℃干烤30分鐘或180℃干烤2小時，也可用其他適宜方法。試驗操作過程應防止微生物的污染。 試驗前需核對使用批號鱟試劑的靈敏度標示值，應符合規(guī)定。裝量加入配帶的鱟試劑溶劑。溶解后，為鱟試劑溶液，備用。 供試品的稀釋：使用批號鱟試劑的靈敏度標示值小于供試品的內毒*時，按下式計算，用內毒素檢查用水將供試劑品稀釋后進行檢查。 供試品的稀釋倍數(shù)=X/λ X：供試品的內毒素*內毒素*(EU/ml) λ：供試品鱟度劑靈敏度標示值(EU/ml)
（3）檢查裝有0.1ml鱟試劑溶液的10×75mm試管(或0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿)4支，其中2支加入0.1ml供試品作為試品管，1支加入2λ內毒素工作標準品0.1ml作為陽性對照管，1支加入配帶的鱟試劑溶液0.1ml作為陰性對照管。將試管輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37±1℃水浴中，保溫60±2分鐘。保溫過程和拿取試管要小心，避免因受到振動造成陰性結果。
（4）結果判斷 將試管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉1800時，管內凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性記錄為(+)凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。供試品2管如為(-)，應認為符合規(guī)定，不再進行熱原檢查法(家兔法)試驗。如2管均為(+)，應認為不符合規(guī)定。如2管中1管為(+)，1管為(-)，按述方法另取4支供試品管復試，4管中有1管為(+)即認為不符合規(guī)定。除正文另有規(guī)定外，有符合規(guī)定的供試品應再以熱原檢查法(家兔法)試驗，并根據(jù)的結果判定。 供試品細菌內毒素的*應符合各品種正文下的規(guī)定。 陽性對照為(-)或陰性對照為(+)，試驗無效。
附： 滅菌注射用水、注射用水、氯化鈉注射液、5%和10%葡萄糖注射液細菌內毒素檢查。

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